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“恒远生物”产品文献:IMD对缺血-再灌注心肌保护ATP敏感性钾通道的作用研究
阅读次数:176  发布时间:2019/4/24 11:15:14

IMD对缺血-再灌注心肌保护ATP敏感性钾通道的作用研究
卫雷 成尚霖 马捷

【摘要】目的 观察心肌缺血期处理后在体大鼠心肌缺血- 再灌注损伤中中介素(Intermedin IMD) 参与情况下的保护机制 ; 研究IMD对心肌细胞的保护作用是否途经ATP敏感性钾通道(ATP-sensitive potassium channel,KATP),为探讨心肌保护机制提供临床思路。方法 选取标准SD 大鼠45 只,随机分为缺血再灌注组(I/R 组)、IMD 治疗组(IMD 组)、格列本脲+IMD 治疗组(Gli+IMD 组),每组15 只。各组分别于再灌注末期分别抽取动脉血3ml,用比色法测定血清CK 和LDH,用ELISA 法测cTnI活性。取心尖部心肌组织,10% 甲醛液固定,石蜡包埋,后在光镜下观察心肌损害程度。结果 IMD 组与I/R 组比较,P <0.01 ; Gli+IMD 组与I/R 组、IMD组比较,P <0.05。结论 IMD在心血管系统中具有保护作用且其机制可能与其激活了ATP敏感性钾通道相关。

【关键词】ATP 敏感性钾通道;缺血再灌注;IMD;心肌保护 doi:10.3969/j.issn.1673-5552.2011.22.0010
【中图分类号】R364.1 【文献标识码】A 【文章编号】1673-5552(2011)22-0021-02


缺血性心脏病(IHD) 已成为西方国家人口死亡的重要原因, 在我国已经上升至人口死亡原因的第二位[1]。关于IHD 的治疗首先是恢复血液灌注,其目的在于解除组织的缺氧和营养物质供应不足的状态,以阻止缺血性损伤的发展或促使其恢复[2]。在对缺血再灌注(Ischemia-reperfusion injury I/R) 损伤的机制研究中,中介素(Intermedin IMD) 也称肾上腺髓质素2(ADM-2),是 2003 年至今新近确认的降钙素基因相关肽超家族成员,广泛表达于啮齿类动物大脑、垂体、肾脏、心脏、肺脏、胃肠道、卵巢,血管内皮细胞[3]。IMD 同家族成员如ADM和CGRP具有多种生物学效应,对多个器官系统有调节作用,已被诸多文献证实具有很强的心血管保护作用。IMD 是一种新的内源性抗损伤保护物质,可能作为心血管疾病防治的新靶点[4,5]。因此,IMD 在心肌缺血再灌注损伤中的保护作用及其机制值得进一步研究。

1材料与方法
1.1实验动物
选用雄性SD大鼠45 只,体重240-300g( 由山西医科大学实验动物中心提供),在常规条件下饲养,普通饮食,自由饮水。
1.2药品、试剂和仪器
IMD( 美国Phoenix 公司)、格列本脲( 上海研域化学试剂有限公司),cTnI 试剂盒(Biosource 公司),乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK) 试剂盒( 上海恒远生化试剂有限公司) ;微型动物呼吸机( 浙江医科大学医疗仪器实验厂) ;心电图机( 上海奥尔科特生物科技有限公司)。
1.3I/R 模型的制备
大鼠称重后以20% 乌拉坦溶液(4ml/kg) 腹腔注射麻醉,仰卧固定,将心电图针状电极插入大鼠四肢皮下,描记肢体Ⅱ导联心电图。常规左侧胸前区备皮,颈正中切开皮肤,钝性分离颈前肌,气管切开置管,连接微型动物呼吸机控制呼吸 ;分离出右颈总动脉,用于插管采集血液样本。沿胸骨左缘第4、5 肋间顺势剪开心包,充分暴露心脏及左心室表面血管,以左冠状动脉前降支(LAD) 为标志,在左心耳根部下方0.3-0.4cm 处进针,6/0 丝线( 结扎线) 穿过心肌组织在肺动脉圆锥旁出针,结扎线两端分别套入丝线环作为再灌注拉线,收紧结扎线使左冠脉前降支闭塞30min,以造成心肌缺血。成功标志为 :心电图ST 段弓背向上抬


作者单位:030001 太原,山西医科大学第二医院心胸外科
作者简介:卫雷(1985-),男,硕士学历。Email:ownfight@163.com通讯作者:马捷

高和结扎线以下血管支配区表面颜色由正常变苍白再变青紫示为心肌缺血。牵拉再灌注拉线使结扎线放松后恢复血流即行再灌注2h,造成I/R 模型。
1.4分组及给药方法
大鼠分组 :缺血再灌注组、IMD 治疗组、格列本脲+IMD 治疗组三组。试验给药 :(I/R) 组即MI 后5min静滴生理盐水至实验结束 ;(IMD组)即MI后5min 给予IMD 0.1nmol/kg,加入生理盐水250ml静滴至实验结束 ;(Gli+IMD组)即MI后5min 给予IMD 0.1nmol/kg 加入生理盐水250ml同时加入格列本脲10μmol/L 静滴至实验结束。给药滴速均控制在0.5ml/min。
1.5检测及观察
各组在造模时分别抽取动脉血3ml至于抗凝离心管中,用2000r/min 离心10min,取上清液,用ELISA 法测cTnI,用比色法测定血清CK 和LDH 活性。
心肌HE病理组织学染色 :实验完毕后取心尖部约100mg 心肌组织,吸水纸脱水固定,常规石蜡包埋,连续切片,从各组中取10 张石蜡切片,二甲苯透明处理,免疫组化HE 染色,梯度乙醇脱水,中性树胶封片,在光学显微镜下观察心肌细胞形态变化。
1.6统计学分析
实验数据以均数± 标准差( ±s)表示,统计学检验应用SPSS16.0 统计软件对实验数据进行分析,各组间比较采用方差分析,两两比较采用t 检验,P <0.05 为有统计学意义。

2结果
2.1各组血清心肌酶比较
与I/R组比较,IMD 组的cTnI、LDH、CK 均下降(P <0.01); 与IMD组比较,Gli+IMD 组的cTnI、LDH、CK均升高(P <0.05)。见表1:


组别 n LDH(U/L) CK(U/L) cTnI(μg/L) I/R 组 15 982.56±83.24 96.16±8.74 1246.06±82.74
IMD 组 15 456.60±54.32▲ 60.32±5.51▲ 879.09±53.20▲
Gli+IMD 组 15 678.33±34.51★ 79.59±6.50★ 1038.05±63.65★
IMD 组与I/R 组比较,各指标▲ P <0.01 ; Gli+IMD 组与I/R 组比较,各指标★
P <0.05;Gli+IMD 组与IMD 组比较,★ P <0.05

2.2各组心肌形态学改变
光镜下I/R组主要表现为胞浆嗜酸性变性,可见广泛大面积呈红染,心肌横纹不清甚至消失,心肌纤维呈波浪状或断裂融合,

22 基础研究 中国医疗前沿 2011年11月 第6卷 第22期 National Medical Frontiers of China, Nov.2011, Vol.6 No.22


肌浆多为不规则粗颗粒,有明显细胞坏死表现,间质可见充血、水肿、出血以及嗜中性粒细胞浸润 ;IMD 组心肌组织细胞胞核大小分布均匀, 胞浆嗜酸性变,心肌纤维轻度拉长、变细,偶见成纤维细胞及炎细胞浸润 ;Gli+IMD 组心肌纤维拉长明显,心肌纤维呈波浪状、排列紊乱不规则,心肌间质出现大量炎细胞浸润。

3讨论
IMD 抑制I/R 损伤是一个复杂的病理过程,自由基生成增多和细胞内钙超载是I/R损伤发病的主要机制[6],文献报道ADM可通过抑制氧化应激和降低钙超载以拮抗心肌I/R损伤且实验观察到IMD1-53 再灌注具有与ADM相似的减少缺血心肌脂质过氧化终产物生成的效应[7,8]。研究表明,自发性高血压大鼠左心室IMDmRNA 表达明显升高,推测IMD 的表达增高是由于氧化应激导致[9]。
ATP敏感性钾通道(ATP-sensitive potassium channel, KATP) 是受细胞内ATP 浓度调控的一种内向整流钾通道,正常情况下处于关闭状态,在组织缺血、缺氧或能量耗竭时被大量激活。近年来研究发现,KATP 通道的激活可调节细胞缺血、缺氧反应,介导并参与细胞或组织器官的保护作用,它可能是心肌保护效应的一个共同通路、启动因子或终末效应器,KATP 的开放能减少线粒体内钙释放、维持缺血/ 低氧后线体粒的稳定性,延缓或减轻缺血/ 低氧后的细胞凋亡[10]。
宋君秋等[11] 研究表明IMD具有抗心肌缺血再灌注损伤的作用,其机制可能与增加抗凋亡蛋白表达和降低氧化应激损伤减少线粒体释放细胞色素C到胞浆,抑制线粒体途径介导的心肌细胞凋亡有关。齐永芬[12] 通过试验总结出IMD通过抑制ERS和氧化应激改善心肌I/R 损伤。综上诸多研究发现,IMD 在保护细胞损伤、抑制凋亡、减轻氧化应激等方面有着突出的优势。研究证实, IMD可通过减少局部活性氧(ROS) 的含量减轻心脏缺血再灌注损伤[13]。IMD 通过G蛋白的介导对门控K+ 通道进行调节,也是其发挥效应的一种方式[14]。这在IMD 的扩血管及调节心肌收缩等方面有重要作用。
研究通过对大鼠心肌缺血再灌注损伤造模观察心肌肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH) 及心肌肌钙蛋白I(cTnI),检测三组血清心肌损伤指标含量评定心肌缺血损伤的程度。结果显示,在IMD 干预后,IMD 组较I/R 组的CK、LDH 及cTnI 含量降低,镜下心肌坏死的损伤病变轻微,提示IMD 可减轻心肌细胞的I/R 性损伤,证实其具有心肌保护效应。同时用格列苯脲+IMD 干预I/R,结果显示Gli+IMD 组较IMD 组的LDH、CK 及cTnI 血清含量升高,镜下心肌坏死较为明显,提示格列苯脲取消了IMD 的保护作用,进一步表明心肌KATP 通道参与了IMD 的心肌细胞保护效应,为临床研究心肌细胞缺血再灌注损伤的作用机制提供重要实验依据。此外,研究还提示, Gli+IMD 组较I/R 组的LDH、CK 及cTnI 血清含量降低,说明格列苯脲虽然一定程度上阻断了IMD 对I/R 心肌细胞损伤的保护效应,但其心肌保护作用并没有完全被阻断,表明IMD 对I/R 心肌细胞损伤的保护效应可能还存在其它机制,诸如通过激活其受体系统和cAMP、NO 途径等发挥作用[15],还有待进一步深入研究。
可见,IMD在心肌细胞缺血再灌注损伤中对参与激活ATP 敏感性钾通道有一定的关联,它具有心肌细胞保护作用,深入研究对于防治心血管疾病具有重要意义。

参考文献
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